ПОЧЕМУ СВЕЧЕНИЕ БЫВАЕТ РАЗНЫМ? Люцифераза: Биосинтез люциферазы светляков...Биолюминесценция: Тайны и загадки "живого" света. Биолюминесценция. Биолюминесцентные системы. Как возникли биолюминесцентные системы?Приспособительный смысл свечения. Свечение организмов: Субстраты и ферменты. Поведение животных

9870 St Vincent Place, Glasgow, DC 45 Fr 45.

+1 800 559 6580

Тайны и загадки "живого" света

Фото

Перейти в оглавление раздела:Поведение и окружающая среда

* Свечение организмов и эволюция

ПОЧЕМУ СВЕЧЕНИЕ БЫВАЕТ РАЗНЫМ?

В природе жуки-светляки отличаются размерами и формой, а цвет излучаемого света у разных видов светляков варьируется от зеленого до оранжевого, т.е. максимум в спектре биолюминесценции изменяется от 490 до 590 нм. Ямайские жуки-щелкуны имеют даже несколько световых органов, испускающих свет неодинакового цвета. В то же время химический механизм биолюминесцентной реакции, структуры исходного люциферина и продукта его окисления - оксилюциферина, излучающего свет, идентичны у всех известных видов жуков-светляков. Таким образом, различия в спектрах биолюминесценции могут быть обусловлены только вариациями в структуре люцифераз, в активном центре которых и рождается электронно-возбужденный оксилюциферин. Методами генной инженерии определены химические структуры люцифераз многих видов светляков и установлено, что их аминокислотные последовательности очень сходны, но не идентичны. С помощью компьютерного анализа первичной структуры белковых цепей всех известных люцифераз светляков и жуков-щелкунов мы выяснили, что цвет биолюминесценции зависит от физико-химических свойств фрагмента, который включает аминокислотные последовательности 223 - 247. Даже точечные замены аминокислот в нем могут приводить к изменению цвета биолюминесценции. Следовательно, вблизи этого фрагмента и находится тот участок белка, который образует микроокружение излучателя - электронно-возбужденного продукта реакции, оксилюциферина.

Чтобы понять, каким образом белковое микроокружение может влиять на спектры люминесценции оксилюциферина, рассмотрим несколько подробнее физико-химический механизм взаимодействия излучателя с окружающими его молекулами растворителя или белковыми фрагментами. Это влияние может быть как специфическим, так и неспецифическим. В первом случае излучатель химически взаимодействует с микроокружением, например, образуя водородные связи или комплексы с переносом заряда. При этом изменяется электронная структура излучателя, а в результате - и спектр люминесценции, причем сильно и дискретно. Именно за счет такого специфического механизма сдвигается спектр биолюминесценции для люциферин - люциферазной системы светляков in vitro при уменьшении рН раствора. Если значения рН среды оптимальны (7.5 - 7.8), то оксилюциферин находится в форме енола и спектр биолюминесценции имеет максимум в диапазоне 550 - 570 нм, т.е. в желто-зеленой области. При уменьшении рН ниже 6.0 протонируются некие группы белка в субстратсвязывающем центре, за счет чего меняется ионное состояние оксилюциферина. Он переходит в форму кетона, и максимум спектра смещается в более длинноволновую область - 620 нм. В среде с промежуточными значениями рН присутствуют обе формы излучателя - енольная и кетонная, и спектр люминесценции оказывается бимодальным.

С другой стороны, микроокружение излучателя (будь то в растворе или в белковом окружении) можно рассматривать как некую непрерывную диэлектрическую среду, которая оказывает неспецифическое влияние на спектр люминесценции. Энергия, выделяемая в виде света при переходе возбужденной молекулы в основное состояние, зависит от разности энергий этих двух состояний. Чем больше эта разность, тем сильнее максимум спектра люминесценции сдвинут в коротковолновую область. Уровни энергии в свою очередь зависят как от электронных структур молекулы оксилюциферина в основном и возбужденном состоянии, так и от энергии взаимодействия излучателя с растворителем, т.е. энергии сольватации. Чем она выше, тем ниже уровень энергии возбужденной молекулы, тем меньше энергия, выделяемая в виде света, и тем больше максимум излучения сдвинут в длинноволновую область при неизменной форме спектра.

Процесс сольватации молекулы излучателя зависит не только от величины энергии его взаимодействия с растворителем, но и от динамических характеристик последнего, другими словами, от скорости переориентации его молекул при контакте с молекулой излучателя. Дело в том, что при переходе оксилюциферина в электронно-возбужденное состояние мгновенно происходит перестройка его электронной структуры (за 10-15 с), резко увеличивается дипольный момент молекулы. В начальный момент возбуждения оксилюциферин находится в "неравновесном" состоянии по отношению к молекулам среды, и лишь после переориентации диполей растворителя в результате движения всей его молекулы, а не только ее электронов, энергия возбужденного состояния излучателя уменьшается. Если за время жизни молекулы возбужденного оксилюциферина (10-9 - 10-8 с) окружающие его молекулы растворителя не успевают переориентироваться, то различие энергий возбужденного и основного состояний будет максимальным, а излучение - наиболее коротковолновым. В том случае, когда молекулы растворителя успевают переориентироваться, возбужденный оксилюциферин переходит в равновесное со средой состояние, и его энергия уменьшается на величину энергии сольватации, а спектр люминесценции сдвигается в длинноволновую область тем сильнее, чем выше поляризуемость и подвижность молекул среды. При возвращении же электронно-возбужденной молекулы в основное состояние наблюдается обратный процесс. Таким образом, стабилизация основного и возбужденного состояний излучателя зависит от времени, поляризуемости и вязкости растворителя.

А как влияет на цвет биолюминесценции белковое микроокружение? Если возбужденный оксилюциферин находится в сильно неполярном микроокружении, он не способен эффективно взаимодействовать с люциферазой. Тогда различие энергий возбужденного и основного состояний излучателя будет максимальным, а излучение - наиболее коротковолновым, т.е. в сине-зеленой области спектра. К такому же результату приводит и белковое микроокружение с высокой жесткостью белкового фрагмента и низкой поляризуемостью аминокислотных остатков (хотя оно и способно эффективно взаимодействовать с излучателем). В этом случае за время жизни возбужденной молекулы оксилюциферина они не успевают переориентироваться, и излучение происходит с более высокого энергетического уровня. Но если само окружение достаточно полярно, высоки подвижность белкового фрагмента и поляризуемость аминокислотных остатков в микроокружении оксилюциферина, то последние успевают перестроиться, и энергия излучателя уменьшается. Чем сильнее его взаимодействие с белком и чем выше подвижность белкового фрагмента в активном центре фермента, тем более максимум спектра биолюминесценции сдвигается в длинноволновую, оранжево-красную, область.

Интересные дополнительные сведения о роли микроокружения излучателя и его поведении в активном центре люциферазы мы получили при изучении флуоресцентных свойств модельной системы - комплекса фермент - оксилюциферин. Флуоресценция этого комплекса являет собой полный аналог стадии излучения света в люциферин - люциферазной системе.

Известно, что каждый элементарный акт флуоресценции - это излучение плоско-поляризованного света. В невязком растворе возбужденные низкомолекулярные частицы, например оксилюциферин, обладают практически свободным вращением, и поэтому поляризация флуоресценции не регистрируется. Иное дело, если в образовании комплекса участвуют крупные частицы, например молекулы белка. Тогда скорость углового вращения излучателя значительно уменьшается, и регистрируемая степень поляризации испускаемого света будет тем выше, чем больше молекулярная масса комплекса и чем он прочнее.

Изучаемый нами комплекс люцифераза - оксилюциферин настолько прочен, что его легко выделить из реакционной среды с помощью хроматографии. Однако мы не наблюдали никаких различий в степени поляризации света, испускаемого оксилюциферином в свободном состоянии и в комплексе с люциферазой. Это может быть связано, на наш взгляд, с высокой подвижностью и свободным вращением возбужденного оксилюциферина в составе комплекса с белком. Зависимость стационарных спектров флуоресценции от pH среды и кинетика затухания процесса при импульсном режиме возбуждения указывают на то, что свойства микроокружения электронно-возбужденного оксилюциферина, когда он находится в комплексе с белком, близки к свойствам растворителя с высокой диэлектрической проницаемостью, например воды. Но ведь это противоречит другим экспериментальным фактам, которые свидетельствуют, что участок белка, связывающий оксилюциферин, гидрофобен, а не гидрофилен, как вода.

Снять противоречие позволит, вероятно, предложенная нами гипотеза "диссоциативного" механизма излучения. В процессе окисления люциферина, связанного в комплекс с ферментом, образуется, как уже упоминалось, молекула оксилюциферина в электронно-возбужденном состоянии. Энергия этой частицы столь велика, а ее окружение термодинамически столь невыгодно, что комплекс белок - продукт разрушается почти мгновенно. Переход возбужденного излучателя в основное состояние, который сопровождается свечением, происходит в околобелковом пространстве в окружении молекул воды, структурированных аминокислотными остатками. Затем оксилюциферин, будучи уже в основном состоянии, вновь связывается с люциферазой, образуя прочный комплекс. Предложенная гипотеза объясняет и зависимость цвета биолюминесценции от структуры белка, и "водоподобное" окружение электронно-возбужденного оксилюциферина, и его свободное вращение в момент излучения света.

Таким образом, кинетические и физико-химические методы исследования механизма биосинтеза и функционирования люциферазы светляков помогли нам проникнуть в некоторые тайны возникновения "живого" света. Возможно, в будущем удастся создать искусственные светящиеся биосистемы с коэффициентом полезного действия, близким к 100%. Но уже и сейчас биолюминесценция находит практическое применение. В последние годы на ее основе создан ряд чувствительнейших методов анализа широкого круга веществ. Это экспресс-методы контроля микробных загрязнений в пищевых продуктах и напитках, быстрые методы иммуноферментного анализа, целевой подбор антибиотиков, иммуномодуляторов, экспресс-диагностика инфаркта миокарда и многие другие. В природе же "живой" свет по-прежнему нужен светящимся существам: одним для привлечения добычи, другим - для защиты от врагов, третьи с его помощью отыскивают партнера, чтобы продолжить свой род.....

Читать очерк сначала: Светящиеся животные

http://vivovoco.rsl.ru/VV/PAPERS/NATURE/BROVKO.HTM ..

РАЗДЕЛЫ
САЙТА